Identification and characterization of novel reptile cathelicidins from elapid snakes

Three cDNA sequences coding for elapid cathelicidins were cloned from constructed venom gland cDNA libraries of Naja atra, Bungarus fasciatus and Ophiophagus hannah. The open reading frames of the cloned elapid cathelicidins were all composed of 576 bp an

眼镜蛇科 cathelicidin 基因的分子克隆及活性研究

Cathelicidins 是天然免疫系统中的一种带正电的宿主防御肽段，它们广泛地 分布在哺乳类及其他一些物种如鱼类，鸟类中。它们均包含保守的前肽区和多变 的C-末端成熟抗菌肽区域，该抗菌肽区域无论是在种间还是种内都不保守。 我们首次分别从爬行纲眼镜蛇科的眼镜蛇，金环蛇，眼镜王蛇三种毒蛇的毒 腺cDNA 文库中克隆了3 个cathelicidin 编码序列。所克隆到的序列编码的开放 阅读框架均长576bp，编码191 个氨基酸残基组成的蛋白前体。从cDNA 开放阅 读框推导得到的毒蛇cathelicidin 都含有22 个氨基酸残基组成的信号肽， 135 个 氨基酸残基组成的cathelin 保守区域以及34 个氨基酸残基组成的成熟肽区域。 与哺乳类中的cathelicidin 基因的高度多样性不同，来源于3 种毒蛇的cathelicidin 基因在核酸和蛋白水平都比较保守。结构分析表明，以上3 种毒蛇的cathelicidin 成熟肽由第157 位的Val 被elastase 切割而产生。采用化学合成法合成推导得到 的眼镜王蛇的cathelicidin（OH-CATH）。在1% NaCl 的浓度下，该合成肽对测试 的多种细菌具有很强的抑菌活性，MIC 值为1-20 μg/ml。与此同时，即使当浓度 高达200 μg/ml 时，该合成的肽段对人的红细胞依然没有溶血活性。对脊椎动物 的cathelicidin 遗传进化树分析发现毒蛇类的cathelicidin 聚在一起。从进化上看， 蛇的cathelicidin 与来源于小鼠、大鼠、兔的中性粒细胞颗粒蛋白更接近。毒蛇 的cathelicidin 可能为新药开发提供了一个很好的模板。

Novel cathelicidin-derived antimicrobial peptides from Equus asinus

In the present study, EA-CATH1 and EA-CATH2 were identified from a constructed lung cDNA library of donkey (Equus asinus) as members of cathelicidin-derived antimicrobial peptides, using a nested PCR-based cloning strategy. Composed of 25 and 26 residues, respectively, EA-CATH1 and EA-CATH2 are smaller than most other cathelicidins and have no sequence homology to other cathelicidins identified to date. Chemically synthesized EA-CATH1 exerted potent antimicrobial activity against most of the 32 strains of bacteria and fungi tested, especially the clinically isolated drug-resistant strains, and minimal inhibitory concentration values against Gram-positive bacteria were mostly in the range of 0.3-2.4 mu g center dot mL-1. EA-CATH1 showed an extraordinary serum stability and no haemolytic activity against human erythrocytes in a dose up to 20 mu g center dot mL-1. CD spectra showed that EA-CATH1 mainly adopts an alpha-helical conformation in a 50% trifluoroethanol/water solution, but a random coil in aqueous solution. Scanning electron microscope observations of Staphylococcus aureus (ATCC2592) treated with EA-CATH1 demonstrated that EA-CATH could cause rapid disruption of the bacterial membrane, and in turn lead to cell lysis. This might explain the much faster killing kinetics of EA-CATH1 than conventional antibiotics revealed by killing kinetics data. In the presence of CaCl2, EA-CATH1 exerted haemagglutination activity, which might potentiate an inhibition against the bacterial polyprotein interaction with the host erythrocyte surface, thereby possibly restricting bacterial colonization and spread.

Two cathelicidin genes are present in both rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and Atlantic salmon (Salmo salar)

Further to the previous finding of the rainbow trout rtCATH_1 gene, this paper describes three more cathelicidin genes found in salmonids: two in Atlantic salmon, named asCATH_1 and asCATH_2, and one in rainbow trout, named rtCATH_2. All the three new salmonid cathelicidin genes share the common characteristics of mammalian cathelicidin genes, such as consisting of four exons and possessing a highly conserved preproregion and four invariant cysteines clustered in the C-terminal region of the cathelin-like domain. The asCATH_1 gene is homologous to the rainbow trout rtCATH_1 gene, in that it possesses three repeat motifs of TGGGGGTGGC in exon IV and two cysteine residues in the predicted mature peptide, while the asCATH_2 gene and rtCATH_2 gene are homologues of each other, with 96% nucleotide identity. Salmonid cathelicidins possess the same elastase-sensitive residue, threonine, as hagfish cathelicidins and the rabbit CAP18 molecule. The cleavage site of the four salmonid cathelicidins is within a conserved amino acid motif of QKIRTRR, which is at the beginning of the sequence encoded by exon W. Two 36-residue peptides corresponding to the core part of rtCATH_1 and rtCATH_2 were chemically synthesized and shown to exhibit potent antimicrobial activity. rtCATH_2 was expressed constitutively in gill, head kidney, intestine, skin and spleen, while the expression of rtCATH_1 was inducible in gill, head kidney, and spleen after bacterial challenge. Four cathelicidin genes have now been characterized in salmonids and two were identified in hagfish, confirming that cathelicidin genes evolved early and are likely present in all vertebrates.

金环蛇抗菌肽cathelicidin-BF的纯化、基因克隆、结构与功能分析及抗菌机理研究

Cathelicidins是动物体内一个具有多功能的抗菌肽家族，目前仅在哺乳类、鸟类、爬行类和鱼类中有发现。Cathelicidins具有广谱的抗微生物活性，不但对普通革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌以及病毒具有非常强的活性，而且对许多临床耐药微生物同样具有作用。除此之外，cathelicidins具有许多其他生物学活性，如对多种免疫细胞具有趋化作用、诱导肥大细胞脱粒和组织胺释放、调节巨噬细胞转录、促进伤口愈合、诱导血管发生、诱导变异细胞系细胞凋亡和淋巴细胞活化等。 金环蛇（Bungarus fasciatus）属于眼镜蛇科（Elapinae）环蛇属（Bungarus），是一种具有前沟牙的毒蛇，广泛分布于我国广东、广西、福建、江西、海南及云南南部。 在本论文中，我们对金环蛇体内cathelicidins家族抗菌肽cathelicidin-BF进行了一系列研究。 通过凝胶过滤、阳离子交换和反相高压液相三步从金环蛇蛇毒冻干粉中分离纯化得到金环蛇cathelicidins家族抗菌肽，命名为cathelicidin-BF。Edman降解法测定其氨基酸序列为KFFRKLKKSVKKRAKEFFKKPRVIGVSIPF，由30个氨基酸残基组成，ESI-MS测得其分子量为3637.5 Da。 构建了金环蛇毒腺cDNA文库，从中克隆得到了编码cathelicidin-BF前体的cDNA序列。该cDNA序列长度为750 bp，由此推断出的cathelicidin-BF前体由191个氨基酸残基组成，包括信号肽区、保守的cathelin区和成熟肽区三部分。用RT-PCR的方法对cathelicidin-BF的组织表达情况进行了研究，结果表明cathelicidin-BF在金环蛇胃、气管、皮肤、肌肉、心脏、肾脏、肺、脑、小肠、脾脏、肝脏、卵巢、毒腺中均有表达，但各组织表达量存在差异。进化分析表明，金环蛇cathelicidin-BF与鸭嘴兽CATH-3在系统进化树中独立成簇，表明金环蛇与鸭嘴兽有着一定的亲缘关系，这为鸭嘴兽在动物进化中分类地位的确定提供了参考资料。 对cathelicidin-BF可能具有的各种生物学活性进行了研究。Cathelicidin-BF具有广谱的抗微生物活性，对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌均有活性，Cathelicidins是动物体内一个具有多功能的抗菌肽家族，目前仅在哺乳类、鸟类、爬行类和鱼类中有发现。Cathelicidins具有广谱的抗微生物活性，不但对普通革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌以及病毒具有非常强的活性，而且对许多临床耐药微生物同样具有作用。除此之外，cathelicidins具有许多其他生物学活性，如对多种免疫细胞具有趋化作用、诱导肥大细胞脱粒和组织胺释放、调节巨噬细胞转录、促进伤口愈合、诱导血管发生、诱导变异细胞系细胞凋亡和淋巴细胞活化等。 金环蛇（Bungarus fasciatus）属于眼镜蛇科（Elapinae）环蛇属（Bungarus），是一种具有前沟牙的毒蛇，广泛分布于我国广东、广西、福建、江西、海南及云南南部。 在本论文中，我们对金环蛇体内cathelicidins家族抗菌肽cathelicidin-BF进行了一系列研究。 通过凝胶过滤、阳离子交换和反相高压液相三步从金环蛇蛇毒冻干粉中分离纯化得到金环蛇cathelicidins家族抗菌肽，命名为cathelicidin-BF。Edman降解法测定其氨基酸序列为KFFRKLKKSVKKRAKEFFKKPRVIGVSIPF，由30个氨基酸残基组成，ESI-MS测得其分子量为3637.5 Da。 构建了金环蛇毒腺cDNA文库，从中克隆得到了编码cathelicidin-BF前体的cDNA序列。该cDNA序列长度为750 bp，由此推断出的cathelicidin-BF前体由191个氨基酸残基组成，包括信号肽区、保守的cathelin区和成熟肽区三部分。用RT-PCR的方法对cathelicidin-BF的组织表达情况进行了研究，结果表明cathelicidin-BF在金环蛇胃、气管、皮肤、肌肉、心脏、肾脏、肺、脑、小肠、脾脏、肝脏、卵巢、毒腺中均有表达，但各组织表达量存在差异。进化分析表明，金环蛇cathelicidin-BF与鸭嘴兽CATH-3在系统进化树中独立成簇，表明金环蛇与鸭嘴兽有着一定的亲缘关系，这为鸭嘴兽在动物进化中分类地位的确定提供了参考资料。 对cathelicidin-BF可能具有的各种生物学活性进行了研究。Cathelicidin-BF具有广谱的抗微生物活性，对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌均有活性，Cathelicidins是动物体内一个具有多功能的抗菌肽家族，目前仅在哺乳类、鸟类、爬行类和鱼类中有发现。Cathelicidins具有广谱的抗微生物活性，不但对普通革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌以及病毒具有非常强的活性，而且对许多临床耐药微生物同样具有作用。除此之外，cathelicidins具有许多其他生物学活性，如对多种免疫细胞具有趋化作用、诱导肥大细胞脱粒和组织胺释放、调节巨噬细胞转录、促进伤口愈合、诱导血管发生、诱导变异细胞系细胞凋亡和淋巴细胞活化等。 金环蛇（Bungarus fasciatus）属于眼镜蛇科（Elapinae）环蛇属（Bungarus），是一种具有前沟牙的毒蛇，广泛分布于我国广东、广西、福建、江西、海南及云南南部。 在本论文中，我们对金环蛇体内cathelicidins家族抗菌肽cathelicidin-BF进行了一系列研究。 通过凝胶过滤、阳离子交换和反相高压液相三步从金环蛇蛇毒冻干粉中分离纯化得到金环蛇cathelicidins家族抗菌肽，命名为cathelicidin-BF。Edman降解法测定其氨基酸序列为KFFRKLKKSVKKRAKEFFKKPRVIGVSIPF，由30个氨基酸残基组成，ESI-MS测得其分子量为3637.5 Da。 构建了金环蛇毒腺cDNA文库，从中克隆得到了编码cathelicidin-BF前体的cDNA序列。该cDNA序列长度为750 bp，由此推断出的cathelicidin-BF前体由191个氨基酸残基组成，包括信号肽区、保守的cathelin区和成熟肽区三部分。用RT-PCR的方法对cathelicidin-BF的组织表达情况进行了研究，结果表明cathelicidin-BF在金环蛇胃、气管、皮肤、肌肉、心脏、肾脏、肺、脑、小肠、脾脏、肝脏、卵巢、毒腺中均有表达，但各组织表达量存在差异。进化分析表明，金环蛇cathelicidin-BF与鸭嘴兽CATH-3在系统进化树中独立成簇，表明金环蛇与鸭嘴兽有着一定的亲缘关系，这为鸭嘴兽在动物进化中分类地位的确定提供了参考资料。 对cathelicidin-BF可能具有的各种生物学活性进行了研究。Cathelicidin-BF具有广谱的抗微生物活性，对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌均有活性，Cathelicidins是动物体内一个具有多功能的抗菌肽家族，目前仅在哺乳类、鸟类、爬行类和鱼类中有发现。Cathelicidins具有广谱的抗微生物活性，不但对普通革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌以及病毒具有非常强的活性，而且对许多临床耐药微生物同样具有作用。除此之外，cathelicidins具有许多其他生物学活性，如对多种免疫细胞具有趋化作用、诱导肥大细胞脱粒和组织胺释放、调节巨噬细胞转录、促进伤口愈合、诱导血管发生、诱导变异细胞系细胞凋亡和淋巴细胞活化等。 金环蛇（Bungarus fasciatus）属于眼镜蛇科（Elapinae）环蛇属（Bungarus），是一种具有前沟牙的毒蛇，广泛分布于我国广东、广西、福建、江西、海南及云南南部。 在本论文中，我们对金环蛇体内cathelicidins家族抗菌肽cathelicidin-BF进行了一系列研究。 通过凝胶过滤、阳离子交换和反相高压液相三步从金环蛇蛇毒冻干粉中分离纯化得到金环蛇cathelicidins家族抗菌肽，命名为cathelicidin-BF。Edman降解法测定其氨基酸序列为KFFRKLKKSVKKRAKEFFKKPRVIGVSIPF，由30个氨基酸残基组成，ESI-MS测得其分子量为3637.5 Da。 构建了金环蛇毒腺cDNA文库，从中克隆得到了编码cathelicidin-BF前体的cDNA序列。该cDNA序列长度为750 bp，由此推断出的cathelicidin-BF前体由191个氨基酸残基组成，包括信号肽区、保守的cathelin区和成熟肽区三部分。用RT-PCR的方法对cathelicidin-BF的组织表达情况进行了研究，结果表明cathelicidin-BF在金环蛇胃、气管、皮肤、肌肉、心脏、肾脏、肺、脑、小肠、脾脏、肝脏、卵巢、毒腺中均有表达，但各组织表达量存在差异。进化分析表明，金环蛇cathelicidin-BF与鸭嘴兽CATH-3在系统进化树中独立成簇，表明金环蛇与鸭嘴兽有着一定的亲缘关系，这为鸭嘴兽在动物进化中分类地位的确定提供了参考资料。 对cathelicidin-BF可能具有的各种生物学活性进行了研究。Cathelicidin-BF具有广谱的抗微生物活性，对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌均有活性，Cathelicidins是动物体内一个具有多功能的抗菌肽家族，目前仅在哺乳类、鸟类、爬行类和鱼类中有发现。Cathelicidins具有广谱的抗微生物活性，不但对普通革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌以及病毒具有非常强的活性，而且对许多临床耐药微生物同样具有作用。除此之外，cathelicidins具有许多其他生物学活性，如对多种免疫细胞具有趋化作用、诱导肥大细胞脱粒和组织胺释放、调节巨噬细胞转录、促进伤口愈合、诱导血管发生、诱导变异细胞系细胞凋亡和淋巴细胞活化等。 金环蛇（Bungarus fasciatus）属于眼镜蛇科（Elapinae）环蛇属（Bungarus），是一种具有前沟牙的毒蛇，广泛分布于我国广东、广西、福建、江西、海南及云南南部。 在本论文中，我们对金环蛇体内cathelicidins家族抗菌肽cathelicidin-BF进行了一系列研究。 通过凝胶过滤、阳离子交换和反相高压液相三步从金环蛇蛇毒冻干粉中分离纯化得到金环蛇cathelicidins家族抗菌肽，命名为cathelicidin-BF。Edman降解法测定其氨基酸序列为KFFRKLKKSVKKRAKEFFKKPRVIGVSIPF，由30个氨基酸残基组成，ESI-MS测得其分子量为3637.5 Da。 构建了金环蛇毒腺cDNA文库，从中克隆得到了编码cathelicidin-BF前体的cDNA序列。该cDNA序列长度为750 bp，由此推断出的cathelicidin-BF前体由191个氨基酸残基组成，包括信号肽区、保守的cathelin区和成熟肽区三部分。用RT-PCR的方法对cathelicidin-BF的组织表达情况进行了研究，结果表明cathelicidin-BF在金环蛇胃、气管、皮肤、肌肉、心脏、肾脏、肺、脑、小肠、脾脏、肝脏、卵巢、毒腺中均有表达，但各组织表达量存在差异。进化分析表明，金环蛇cathelicidin-BF与鸭嘴兽CATH-3在系统进化树中独立成簇，表明金环蛇与鸭嘴兽有着一定的亲缘关系，这为鸭嘴兽在动物进化中分类地位的确定提供了参考资料。 对cathelicidin-BF可能具有的各种生物学活性进行了研究。Cathelicidin-BF具有广谱的抗微生物活性，对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌均有活性，Cathelicidins是动物体内一个具有多功能的抗菌肽家族，目前仅在哺乳类、鸟类、爬行类和鱼类中有发现。Cathelicidins具有广谱的抗微生物活性，不但对普通革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌以及病毒具有非常强的活性，而且对许多临床耐药微生物同样具有作用。除此之外，cathelicidins具有许多其他生物学活性，如对多种免疫细胞具有趋化作用、诱导肥大细胞脱粒和组织胺释放、调节巨噬细胞转录、促进伤口愈合、诱导血管发生、诱导变异细胞系细胞凋亡和淋巴细胞活化等。 金环蛇（Bungarus fasciatus）属于眼镜蛇科（Elapinae）环蛇属（Bungarus），是一种具有前沟牙的毒蛇，广泛分布于我国广东、广西、福建、江西、海南及云南南部。 在本论文中，我们对金环蛇体内cathelicidins家族抗菌肽cathelicidin-BF进行了一系列研究。 通过凝胶过滤、阳离子交换和反相高压液相三步从金环蛇蛇毒冻干粉中分离纯化得到金环蛇cathelicidins家族抗菌肽，命名为cathelicidin-BF。Edman降解法测定其氨基酸序列为KFFRKLKKSVKKRAKEFFKKPRVIGVSIPF，由30个氨基酸残基组成，ESI-MS测得其分子量为3637.5 Da。 构建了金环蛇毒腺cDNA文库，从中克隆得到了编码cathelicidin-BF前体的cDNA序列。该cDNA序列长度为750 bp，由此推断出的cathelicidin-BF前体由191个氨基酸残基组成，包括信号肽区、保守的cathelin区和成熟肽区三部分。用RT-PCR的方法对cathelicidin-BF的组织表达情况进行了研究，结果表明cathelicidin-BF在金环蛇胃、气管、皮肤、肌肉、心脏、肾脏、肺、脑、小肠、脾脏、肝脏、卵巢、毒腺中均有表达，但各组织表达量存在差异。进化分析表明，金环蛇cathelicidin-BF与鸭嘴兽CATH-3在系统进化树中独立成簇，表明金环蛇与鸭嘴兽有着一定的亲缘关系，这为鸭嘴兽在动物进化中分类地位的确定提供了参考资料。 对cathelicidin-BF可能具有的各种生物学活性进行了研究。Cathelicidin-BF具有广谱的抗微生物活性，对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌均有活性，其中包括大量临床分离耐药菌株。Cathelicidin-BF对革兰氏阴性细菌的活性要强于革兰氏阳性细菌，此外对白色念珠菌、毕赤酵母和一些腐生性真菌也具有活性。Cathelicidin-BF的抗氧化活性、溶血活性、凝集素活性、丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂活性、细胞毒性、抗肿瘤活性均不明显。Cathelicidin-BF具有很强的肥大细胞脱颗粒活性。以上结果表明cathelicidin-BF在金环蛇抵御外界病原微生物侵袭的先天免疫反应中可能发挥了重要作用。 利用多种实验方法对cathelicidin-BF的结构和抗菌机理进行了研究。CD和NMR的实验结果表明，在亲水环境中，cathelicidin-BF为无规卷曲的构象；在疏水或模拟细菌细胞质膜的环境中，cathelicidin-BF的N-末端区域具有典型的两亲性α-螺旋构象。杀菌动力学实验结果表明，cathelicidin-BF杀菌作用极其迅速，在浓度大于1×MIC时，在1 min内即可杀死所有细菌，且其杀菌作用是致死性的。扫描电镜结果表明，经过cathelicidin-BF处理的细菌细胞形状发生明显改变，细胞膨胀变形，表面出现大量囊泡状结构。大量细菌细胞破裂溶解，内容物外泄。综合以上结果我们推测：cathelicidin-BF在亲水的环境中为无规卷曲的结构，当通过静电相互作用吸附到细菌细胞质膜上后，由于环境疏水性的增加其N-端转变为两亲性的α-螺旋构象。Cathelicidin-BF的疏水侧插入到细菌细胞质膜内部，亲水侧暴露于细菌细胞质膜表面。随着结合到细菌细胞质膜上的cathelicidin-BF分子不断增加，细菌细胞质膜内陷，最终在细菌细胞质膜上形成孔洞。细菌细胞内容物大量外流，最终导致细菌细胞的死亡。 通过体外和体内多个实验对cathelicidin-BF进行了初步的药理学和药效学研究。Cathelicidin-BF在血清中稳定性较差，容易被血清中各种蛋白酶降解。一定浓度的盐离子能够增强cathelicidin-BF的抗菌活性。动物模型实验表明，cathelicidin-BF对多种细菌引起的小鼠皮肤感染具有很好的治疗效果。Cathelicidin-BF本身所具有的特点及动物模型实验中表现出的极佳的治疗效果使其成为外用抗菌药物开发的优良模板。